1.離心技術的基礎理論

（1）離心式冷水機組工作原理

離心是利用旋轉(zhuǎn)運動的離心力以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差異進行分離、濃縮和提純生物樣品的一種方法。懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而使溶液得以分離，顆粒的沉降速度取決于離心機的轉(zhuǎn)速、顆粒的質(zhì)量、大小和密度。

當含有細小顆粒的懸浮液靜置不動時，由于重力場的作用可使得懸浮的顆粒逐漸下沉，顆粒越重，下沉越快。微粒在重力場下移動的速度與微粒的大小、形態(tài)、密度、重力場的強度及液體的黏度有關。如紅細胞顆粒，直徑為數(shù)微米，可以在通常重力作用下觀察到它們的沉降過程。此外，物質(zhì)在介質(zhì)中沉降時還伴隨有擴散現(xiàn)象（擴散是由于微粒的熱運動而產(chǎn)生的質(zhì)量遷移現(xiàn)象,主要是由于密度差引起的）。對小于幾微米的微粒如病毒或蛋白質(zhì)等，它們在溶液中成膠體或半膠體狀態(tài)，僅僅利用重力是不可能觀察到沉降過程的，因為顆粒越小沉降越慢，而擴散現(xiàn)象則越嚴重。擴散現(xiàn)象是不利于樣品分離的，如果加大重力，就可能克服擴散現(xiàn)象的不利影響,實現(xiàn)生物大分子的分離。離心機就是利用離心機轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的強大的離心力，迫使液體中微?？朔U散加快沉降速度，把樣品中具有不同沉降系數(shù)和浮力密度的物質(zhì)分離開。

（2）離心力與相對離心力

離心力：當物體所受外力小于運動所需要的向心力時，物體將向遠離圓心的方向運動。物體遠離圓心運動的現(xiàn)象稱為離心現(xiàn)象也叫離心運動。離心運動是由于向心力消失或不足而造成的。

相對離心力：是指在離心場中，作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度"g"。

（3）液體中的微粒在重力場中的分離

重力沉降：液體中的微粒受重力的作用，較重的微粒下沉與液體分開，這個現(xiàn)象稱為重力沉降。

沉降速度：指在強大離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運動的距離。

沉降時間：在實際工作中，常常遇到要求在已有的離心機上把某一種溶質(zhì)從溶液中全部沉降分離出來需用多大轉(zhuǎn)速與多長時間可達到目的的問題。如果轉(zhuǎn)速已知，則需確定分離某粒子所需的時間即沉降時間。

（4）液體中的微粒在重力場中的沉降

①當離心機開動時，離心管繞離心轉(zhuǎn)頭的軸旋轉(zhuǎn)，作圓周運動（見圖3-1），在離心管內(nèi)的樣品顆粒將同樣運動；②假如顆粒是處于真空中（即沒有介質(zhì)阻力時），顆粒會沿切線方向飛去，也就是當離心管由0位轉(zhuǎn)到1位時，顆粒到達離心管底部A位。對于離心管而言，樣品顆粒由頂位移到了A位，也就是由離心管頂部移到了底部，這與重力場中的由高處落到低處相似。這種顆粒在圓周運動時的切線運動稱為離心沉降；③顆粒作切線運動時將由于介質(zhì)的摩擦阻力，使其在離心管中依圖3-1中虛線所示的曲線運動，當離心管由0位轉(zhuǎn)到2位時，顆粒由頂位移到B位。介質(zhì)的阻力越大，顆粒在離心管中沉降速度越小，沉降的距離也越短。旋轉(zhuǎn)速度越大，顆粒在離心管中沉降越快。

2常用的離心方法

(1)差速離心法(又稱分步離心法)采用不同的離心速度和離心時間,使沉降速度不同的顆粒分步離心的方法,稱為差速離心。操作時,將含有兩種不同顆粒的混懸液,以常速離心，使大的顆粒下沉，將上清液傾倒于另一離心管中，再加大離心力，離心一定時間，分離小的顆粒，反復多次分離，達到分離目的。差速離心主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒。差速離心法的優(yōu)點是：操作簡單，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子；分離時間短、重復性高；樣品處理量大。缺點是：分辨率有限、分離效果差，沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開，不能一次得到純顆粒；壁效應嚴重，特別是當顆粒很大或濃度很高時，在離心管一側(cè)會出現(xiàn)沉淀；顆粒被擠壓，離心力過大、離心時間過長會使顆粒變形、聚集而失活。

(2)密度梯度離心法(又稱區(qū)帶離心法)該法又分為速率區(qū)帶離心法和等密度區(qū)帶離心法。樣品在一定惰性梯度介質(zhì)中進行離心沉淀或沉降平衡，在一定離心力下把顆粒分配到梯度液中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。該法的優(yōu)點是：具有很好的分辨率，分離效果好，可一次獲得較純顆粒；適用范圍廣，既能分離沉淀系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度的顆粒；顆粒不會積壓變形，能保持顆粒活性，并防止已形成的區(qū)帶由于對流而引起混合。缺點是：離心時間較長；需要制備梯度液；操作嚴格，不宜掌握。

①速率區(qū)帶離心法：是根據(jù)分離的粒子在離心力作用下，在梯度液中沉降速度的不同，離心后具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)形成幾條分開的樣品區(qū)帶，達到彼此分離的目的。臨床常使用的分離液是Ficoll、Percoll及蔗糖。把靜脈血中單個核細胞分離出來，前一種分離液將血液中單個核細胞（淋巴細胞和單核細胞）分為一個層，同時提出。而Percoll分離液將血中淋巴細胞和單核細胞分為二個梯度層，分別提取。后者分離效果優(yōu)于前者，但操作繁瑣。

②等密度區(qū)帶離心法：當不同顆粒存在浮力密度差時，在離心力場下，顆粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移動到它們密度恰好相等的位置上（即等密度點）形成區(qū)帶，稱為等密度區(qū)帶離心法。等密度區(qū)帶離心的有效分離取決于顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒的大小和形狀無關，但后兩者決定著達到平衡的速率、時間和區(qū)帶的寬度。

（3)分析性超速離心法

①分析型超速離心機的工作原理：分析型超速離心機主要由一個橢圓形的轉(zhuǎn)子、一套真空系統(tǒng)和一套光學系統(tǒng)所組成。該轉(zhuǎn)子通過一個柔性的軸連接成一個高速的驅(qū)動裝置，此軸可使轉(zhuǎn)子在旋轉(zhuǎn)時形成自己的軸。轉(zhuǎn)子在一個冷凍的真空腔中旋轉(zhuǎn)，其容納兩個小室：分析室和配衡室。分析室的容量一般為1ml，呈扇形排列在轉(zhuǎn)子中，其工作原理與一個普通水平轉(zhuǎn)子相同。分析室有上下兩個平面的石英窗，離心機中裝有的光學系統(tǒng)可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質(zhì)，可以通過對紫外光的吸收（如對蛋白質(zhì)和DNA）或折射率的不同對沉降物進行監(jiān)測。在分析室中物質(zhì)沉降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就像一個折射的透鏡，結(jié)果在檢測系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)出一個"峰"，由于沉降不斷進行，界面向前推進，故"峰"也在移動，從峰移動的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標。

②分析性超速離心法的應用范圍：測定生物大分子的相對分子重量。測定相對分子重量中應用最廣的是沉降速度法，用照相記錄，即可求出粒子的沉降系數(shù)。生物大分子的純度估計。分析型超速離心機已廣泛地應用于研究DNA制劑、病毒和蛋白質(zhì)的純度。分析生物大分子中的構(gòu)象變化?？梢酝ㄟ^檢查樣品在沉降速度上的差異來證實。

3離心機的分類與結(jié)構(gòu)

（1）離心機的分類國際上對離心機的分類方法有三種，按用途分、按轉(zhuǎn)速分、按結(jié)構(gòu)分。按用途可分為制備型、分析型和制備分析兩用型；按轉(zhuǎn)速分類可分為低速、高速、超速等離心機；按結(jié)構(gòu)可分為臺式、多管微量式、細胞涂片式、血液洗滌式、高速冷凍式、大容量低速冷凍式、臺式低速自動平衡離心機等。

（2）低速離心機它主要用作血漿、血清的分離及腦脊液、胸腹水、尿液等有形成份的分離；高速離心機：它主要用于臨床實驗室分子生物學中的DNA、RNA的分離和基礎實驗室對各種生物細胞、無機物溶液、懸浮液及膠體溶液的分離、濃縮、提純樣品等；超速離心機：超速離心機按用途分為制備型、分析型及分析制備兩用型三種。制備型超速離心機主要用于生物大分子、細胞器和病毒等的分離純化，能使亞細胞器分級分離，并可用于測定蛋白質(zhì)及核酸的分子量；分析型超速離心機裝有光學系統(tǒng)，可拍照、測量、數(shù)字輸出、打印自動顯示系統(tǒng)等，可以通過光學系統(tǒng)對測試樣品的沉降過程及純度進行觀察。

（3）專用離心機

①免疫血液離心機:用于臨床輸血、血型鑒定、交叉配血、淋巴細胞分離、血小板分離以及抗人球蛋白試驗等。

②微量毛細管離心機:用于血溶比試驗，微量血細胞比積以及放射性核素微量標記物的測定。

③尿沉渣分離離心機:用于尿液中有形成分的分離與尿液工作站相配套。

④細胞涂片離心機:用于腦脊液、胸腹水的脫落細胞的分離及涂片。

（4）低速離心機、高速（冷凍）離心機及超速（冷凍）離心機的結(jié)構(gòu):①低速離心機的結(jié)構(gòu)由電動機、離心轉(zhuǎn)盤（轉(zhuǎn)頭）、調(diào)速器、定時器、離心套管與底座等主要部件構(gòu)成。②高速（冷凍）離心機的結(jié)構(gòu)由轉(zhuǎn)動裝置、速度控制系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、離心室、離心轉(zhuǎn)頭及安全保護裝置等。③超速(冷凍)離心機主要由驅(qū)動和速度控制、溫度控制、真空系統(tǒng)和轉(zhuǎn)頭四部分組成。

（5）離心轉(zhuǎn)頭的分類應用及功能：離心機轉(zhuǎn)頭一般可分為五大類有①固定角轉(zhuǎn)頭②甩平式轉(zhuǎn)頭③連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭④區(qū)帶轉(zhuǎn)頭⑤垂直轉(zhuǎn)頭。

（6）離心機的主要技術參數(shù)及性能指標：主要參數(shù)包括：最大轉(zhuǎn)速；最大離心力；最大容量；電源功率；溫度控制范圍；工作電壓；調(diào)速范圍。離心機轉(zhuǎn)頭的常用標記及轉(zhuǎn)頭參數(shù)。離心機轉(zhuǎn)頭的常用標記是由三部分組成，第一部分為英文字母符號；第二部分為數(shù)字；第三部分為標識轉(zhuǎn)頭由不同的金屬組成。轉(zhuǎn)頭參數(shù)有，Rmax、Rmin、RCFmax、RCFmin、RPMmax、Ｋ等。

4離心機的應用和維護

（1）離心方法的選擇:選擇合適的離心轉(zhuǎn)速和離心時間，就能達到較好的分離效果。①若樣品中存在兩種以上質(zhì)量和密度不同的樣品顆粒，可采用差速離心法。②對于有密度梯度差異的樣品介質(zhì)，可采用密度梯度離心法。③若不同樣品顆粒的密度范圍在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，離心時密度不同的物質(zhì)顆粒因浮力差異或向下沉降，或向上漂浮，一直移到它們各自密度恰好對應的位置（等密度點），形成區(qū)帶。可采用等密度梯度離心。

（2）離心時間以及溫度和pH值的確定

離心時間：依據(jù)離心方法的不同有所差別。①差速離心是指某種顆粒完全沉降到離心管底的時間。②等密度梯度離心是指顆粒完全到達等密度點的平衡時間。③密度梯度離心所需的離心時間則是指形成界限分明的區(qū)帶的時間。

溫度和pH值：為了防止欲分離物質(zhì)的凝集、變性和失活，除了在離心介質(zhì)的選擇方面加以注意外，還必須控制好溫度及介質(zhì)溶液的pH值等離心條件。離心溫度一般控制在40C左右，對于某些熱穩(wěn)定性較好的酶等，也可以在室溫下進行。

（3）離心機的使用、維護：各類離心機因其轉(zhuǎn)速高，產(chǎn)生的離心力大，使用不當或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴重事故，因此使用離心機時都必須嚴格遵守操作規(guī)程。

（4）離心機常見故障及排除方法：①電機不轉(zhuǎn)②轉(zhuǎn)頭的損壞③機體震動劇烈、響聲異常。有許多故障為不正確操作所致，正確操作可減少或消除故障。在工作過程中，如出現(xiàn)任何異?，F(xiàn)象均應立即停機，檢查原因，不得強行運轉(zhuǎn)，以免產(chǎn)生不必要的損失。

5離心方法和離心機的進展

離心機的類型也越來越新穎,伊朗正在對將擁有更強力的轉(zhuǎn)子，旋轉(zhuǎn)速度更快，濃縮能力更強的P2離心機展開研究；俄羅斯立薩馬拉醫(yī)科大學的專家，已研制出了使下肢骨折患者更快地康復的新型醫(yī)用離心機并用于臨床治療；國內(nèi)的一種結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、適應性強、安裝使用維修方便、分離時顆粒不易破壞的ＳＳ型三足式離心機已廣泛應用于各行業(yè)和科研實驗室。

目前，離心方法已逐漸走向規(guī)范化、標準化、專業(yè)化。各種專用離心機，對所分離樣品由計算機自動控制程序設定了一定的轉(zhuǎn)速、相對離心力及離心時間等。

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